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一、 实验原理
本产品实验原理为端粒酶重复序列扩增法（TRAP）。将活细胞或新鲜冻存的细胞或组织（端粒酶具有活性）裂解后，检测提取物中端粒酶的活性。在特定的缓冲液条件中，端粒酶可以利用dNTPs在寡核苷酸末端催化合成端粒重复序列，将端粒酶扩增产物经实时定量PCR扩增后，利用核酸荧光SYBP
Green检测扩增产物的荧光信号，从而推算出端粒酶的活性。
二、 实时定量PCR带给你的不同体验
方便：反应混合物中包括了除模板以外的其他反应成分；
快速：整个实验可在几小时内完成；
敏感：可检测出很低水平（譬如1-5个293T细胞）的端粒酶活性；
稳定：实时定量PCR的分析系统可以有效减少实验的系统误差；
定量：TSR模板提供阳性对照和定量标准。
三、 端粒酶定量检测试剂盒（QTD Kit）
端粒酶定量检测试剂盒是专门为实时PCR检测端粒酶的活性而设计的。试剂盒提供了进行实时PCR反应的各种组分，只需加入模板和PCR用水即可。通过检测掺入双链DNA中的SYBR
Green染料的荧光信号的强度实现定量检测。
端粒酶定量检测试剂盒的成分：
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目录编号 MT3010 MT3011 MT3012
包含反应数 50 100 200
2 x QTD混合物 0.65 ml 1.25 ml 2 x 1.25 ml
1 细胞溶解缓冲液 1.8 ml 2 x 1.8 ml 2 x 1.8 ml
PCR级水 1.8 ml 2 x 1.8 ml 2 x 1.8 ml
对照模板 TSR (0.5 amol/l) 20 l 20 l 20 l
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保存和稳定性：
端粒酶定量检测试剂盒可以贮存在2-8 12个月在性能上没有任何降低。
注意事项：
１、端粒酶是由RNA和相关蛋白质组成的一种核糖核蛋白，对RNA酶及蛋白酶敏感，应保证被检测的细胞和组织样品中的端粒酶的活性。另外，由于实时PCR是高度敏感的检测方法，实验过程中为预防PCR残余污染及RNA酶的污染，应开辟专门的实验区域并采取预防措施。
２、工作中应采取适当的防护措施，请穿工作衣、戴手套。
四、 QTD检测方法
实验方法
- 制备提取物
① 离心沉淀细胞或组织，PBS洗一遍，离心沉淀，小心弃去PBS，将沉淀于－80℃冻存（－80℃冻存一年端粒酶的活性不受影响）。融解后应立即加入1×裂解缓冲液。
② 按200 l/105～106细胞或200 l/40～100mg组织加入1×裂解缓冲液，重悬沉淀。
③ 冰浴30min。
④ 12,000x g ，4 C，离心30min。
⑤ 测定上清中的蛋白含量。
⑥ 将上清分装，液氮速冻后于－8℃保存。
- 实验对照
①阴性对照
端粒酶是一种对热敏感的酶，85℃加热10min可以使之失活。每组实验需设立加热失活的样品作为阴性对照。
②阳性对照
端粒酶RNA（TSR）是一段寡核苷酸，作为阳性对照反应的模板。用系列倍比稀释的TSR作为模板进行实时PCR，绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中由端粒酶催化合成的端粒重复序列的拷贝数，由此推算出端粒酶的活性。
试剂盒中TSR储存液的浓度为0.5amol/ l，用裂解缓冲液进行一系列1:5倍稀释，得到的模板的浓度分别为0.1
amoles/ l、0.02 amoles/ l、0.004 amoles/ l、0.0008 amoles/
l、0.00016 amoles/ l。稀释后的模板可以4℃保存两周。PCR反应体系中加入1 l系列稀释的模板即可。
- 实时PCR法检测端粒酶活性
①实时PCR反应
按下表制备总的反应混合物，表中所示为一个反应的体积，根据总的反应数相应扩大。（本试剂盒使用的是热激活的Taq酶，制备反应混合物时无需在冰上操作。）
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2 x QTD 反应混合液 12.5 l
细胞或组织提取物t 1.0 l
PCR 用水 11.5 l
总体积 25.0 l
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充分混合总的反应混合物后，平均分配至PCR反应管中或薄壁PCR板中。
在反应管中分别加入1 l细胞裂解液或组织提取液、热失活的提取液及阳性对照模板。
按照下表所示设定PCR反应程序。
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步骤 时间 温度 备注
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端粒酶反应 20min 25℃ 端粒酶催化合成6碱基的重复序列并添加至引物的末端
热激活 10min 95℃ 高温下活化热激活的TaqDNA聚合酶加热的这一步被激活
3步循环:
变性 30sec 95℃
退火 30 sec 60℃
延伸 30 sec 72℃
循环数 35-40 循环 循环数可根据模板DNA的量增减
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熔解曲线的分析。推荐进行熔解曲线分析确定反应的特异性和精确定量。分析软件由实时PCR仪提供，可参照PCR仪的说明进行分析，一般应在65℃～95℃之间进行熔解曲线的分析。
实时检测。实时定量是指在PCR进行的过程中连续进行数据的收集，反应结束后，绘制Ct值标准曲线。Ct（threshold
cycle）值指每个反应管中的荧光信号达到设定的域值所经历的循环数。域值（threshold）定义为循环的早期阶段荧光信号的标准差乘以一个系数，一般×10。如下图所示，在PCR反应的指数期，当反应管中与阴性对照管中的荧光信号的差异可以被检测到的循环数即为该样品的Ct值。
- 疑难解答
A.荧光信号没有显著的提高。
1.PCR退火时间太短。
采用推荐的退火时间30-45秒。
2.延伸时间太短。
采用推荐的延伸时间。
3. 热激活的Taq DNA 聚合酶没有活性
确保反应程序中包含了热激活步骤95 C， 15 min。
4. PCR退火温度太高。
将退火温度降低2 C
5.细胞提取物中没有足够的端粒酶。
在冰浴条件下制备细胞和组织提取物，尽量缩短制备时间。
6.端粒酶的反应时间不够。
保证反应时间不少于20min。
7.没有进行活性检测。
确保PCR仪的荧光检测系统是打开状态。
B.CT值和模板量没有线性关系。
模板用量过高，不要超过推荐使用量。
C.所有反应的样品和阴性对照都成阳性
PCR残余污染。
PCR反应的每一组分勿重复使用
保证使用洁净的PCR管和PCR试管架
将实验准备区与PCR扩增和检测区分开
D.在热失活的模板中检测到高的荧光信号。
提取物热不敏感或没有进行充分的热失活
应确保热失活的温度
E .PCR残余污染
参考C。
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